在分子生物学实验中，大肠杆菌（Escherichia coli）作为最常用的宿主菌株之一，其高效转化能力至关重要。感受态细胞是指处于一种特殊生理状态的大肠杆菌细胞，这种状态下的细胞膜通透性增加，能够吸收外源DNA分子，从而实现基因工程操作中的克隆与表达。因此，制备高质量的感受态细胞是成功完成基因重组实验的基础。

一、实验目的

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法，并了解其原理及应用价值。最终目标是获得高转化效率的感受态细胞，为后续的分子生物学研究奠定基础。

二、实验原理

大肠杆菌在特定条件下会进入一种生理状态——感受态。此时，细胞壁和细胞膜的结构发生变化，使得DNA等外来物质更容易穿过细胞壁进入细胞内部。通常情况下，这种状态仅能维持数小时，因此需要及时使用或保存。

三、实验材料与仪器

（1）材料：

- 大肠杆菌DH5α或BL21菌株；

- LB液体培养基；

- 无水乙醇；

- 超纯水；

- 甘油；

- CaCl₂溶液（0.1 M）；

- 氯化钠（NaCl）；

- 磷酸氢二钾（K₂HPO₄）；

- 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。

（2）仪器设备：

- 恒温摇床；

- 离心机；

- 冰箱；

- 恒温水浴锅；

- 无菌操作台。

四、实验步骤

1. 菌种活化

从-80℃冰箱中取出保存的大肠杆菌菌种，在LB固体培养基上划线接种，置于37℃恒温培养箱中培养约12小时，直至形成单菌落。

2. 种子液制备

挑取单菌落接种至5 mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养约4小时，使细菌达到对数生长期（OD₆₀₀值约为0.6-0.8）。然后按1:100的比例将种子液接种到新鲜的LB液体培养基中，继续培养至相同OD值。

3. 制备感受态细胞

当培养液达到所需OD值后，立即冰浴冷却10分钟，随后以4000 rpm离心10分钟收集菌体。弃去上清液，用预冷的CaCl₂溶液重悬菌体，再次离心并重复此过程两次。最后一次洗涤后，用终浓度为5%的甘油重悬菌体，分装成小份并快速冷冻保存于-80℃。

4. 转化效率测试

取适量感受态细胞与外源质粒混合，按照标准转化程序进行操作，计算转化效率。

五、注意事项

1. 整个实验过程中必须保持低温环境，避免温度升高导致细胞丧失感受态。

2. 使用的所有试剂均需提前预冷处理。

3. 操作时注意无菌操作，防止污染影响实验结果。

六、总结

通过以上步骤，我们成功制备了高效转化的大肠杆菌感受态细胞。这些细胞不仅适用于常规的分子克隆实验，还能够在工业生产中发挥重要作用。希望本次实验能够帮助大家更好地理解大肠杆菌感受态细胞的制备及其重要性。